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轉基因技術的應用實例 轉基因技術的應用( 三 )

生活百科轉基因


聚乙二醇介導法：聚乙二醇（PEG）法是由Dayey等在1980年首次建立的 。它的原理是在高pH條件下的PEG與原生質體（脫去全部細胞壁的細胞）融合，原生質體膜的通透性發生改變，增強了原生質對外源DNA的吸收，使目的基因整合到原生質體的基因組上并使之發生特異表達 。該法對細胞的副作用小，轉化的穩定性、重復性好，并能實現一次轉化多個原生質體，但是該法的轉化率較低 。因為PEG對原生質體有一定的毒害作用，所以該方法不能用于原生質培養，也不能用于再生困難的植物 。
電激穿孔法：Michael等人于1985年首次使用電激穿孔法進行轉基因，在1400V的高壓條件下處理細胞質膜，使外源基因導入，在培養2～4天后的原生質體中檢測到外源基因的瞬時表達 。電激穿孔法的原理是當植物細胞受到外界高壓電擊時，細胞膜會出現非對稱穿孔，但這種開放小孔的出現是具有可逆性的，解除電擊后這些小孔會關閉，所以在此期間要利用這種小孔作為外源基因導入細胞的通道，從而使目的基因導入并整合到受體細胞的基因組上 。到目前為止，電激穿孔法相繼成功地應用于煙草、番茄、玉米、大豆、小麥和馬鈴薯等植物原生質體的轉化 。該法操作相對簡單，但是轉化效率較低 。
花粉管通道法：1983年科學家周光宇通過研究我國遠緣雜交提出了DNA片段雜交的假設，為花粉管通道法提供了理論基礎，并首次通過花粉管通道法將海島棉基因轉入陸地棉，并培育出抗枯萎病棉花新品種 。該法的主要原理是在植物開花之際，向植物花器的子房中注入含外源目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步整合到植物細胞的基因組中，然后隨著受精卵的發育而產生轉基因的新個體 。該法最大的優點是不依賴植物組織培養，無需特殊儀器設備，技術簡單，但是該法的重復性還有待于進一步提高 。
目前微生物轉基因方法主要包括氯化鈣（CaCl2）法和電轉法 。
氯化鈣（CaCl2）法：該法最先由Cohen于1972年建立 。其原理是細菌處于0℃ CaCl2的低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶（DNase）的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，促使細胞吸收DNA復合物，在適當的培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，被轉化的細菌中，重組子中基因得到表達，在選擇性培養基平板上，可選出所需的轉化子 。Ca2 處理的感受態細胞，其轉化率一般能達到5×106～2×107轉化子/μg質粒DNA，可以滿足一般的基因克隆試驗 。如在Ca2 的基礎上，聯合其他的二價金屬離子（如Mn2 、Co2 ）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，則可使轉化率提高100-1000倍 。化學法簡單、快速、穩定、重復性好、菌株適用范圍廣，感受態細菌可以在-70℃保存，因此被廣泛用于細菌外源基因的轉化 。

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